Великаны в стране лилипутов: описаны бактериофаги с рекордно большими геномами

[Виктория Мишустина]

Как правило, бактериофаги имеют небольшие геномы, состоящие из нескольких десятков тысяч пар оснований. Некоторое время назад были опубликованы результаты исследования проб самого разного происхождения: образцы брали из морской и пресной воды, из почвы, горячих источников, слюны и фекалий людей и животных. Метагеномный анализ выявил сотни бактериофагов, геномы которых состояли из более чем 200 тысяч пар оснований. Один из обнаруженных бактериофагов имеет геном из 737 тысяч пар оснований — это абсолютный рекорд для вирусов бактерий. Функции некоторых генов удалось определить: оказалось, что у найденных бактериофагов есть гены, кодирующие тРНК, тРНК-синтетазы, ферменты, модифицирующие тРНК, факторы инициации и элонгации трансляции, рибосомные белки и белки системы CRISPR/Cas, которые используются фагами для регуляции экспрессии клеточных генов и конкурентной борьбы с другими фагами.

Бактериофаги (или просто фаги) — это вирусы, заражающие бактерий и архей. Попав в подходящую клетку, бактериофаг (как и любой вирус) подчиняет себе клеточный аппарат синтеза белка, заставляя ее производить белки, необходимые для построения новых вирусных частиц. Такое интенсивное размножение истощает клетку-жертву и в конце концов она погибает. Впрочем, активная фаза размножения вируса не всегда начинается сразу после проникновения в клетку: иногда фаги встраиваются в геном бактерии-хозяина и «затихают» на некоторое время, пребывая в покоящемся состоянии. Такую стадию жизненного цикла вируса называют профагом. Триггером выхода из покоя и начала размножения вируса могут стать неблагоприятные внешние условия, препятствующие размножению бактерий.

Бактериофаги были открыты больше ста лет назад. Это произошло после того, как было замечено, что лабораторные культуры бактерий страдают от чего-то, что явно передается из культуры в культуру и при этом является очень маленьким и невидимым. Целенаправленные исследования позволили французско-канадскому микробиологу Феликсу Д'Эреллю разобраться с тем, что именно вызывает гибель бактерий, и объявить об открытии бактериофагов в сентябре 1917 года. Он же первым успешно вылечил пациента от дизентерии при помощи фаготерапии (см. Phage therapy). В доантибиотиковую эпоху это было серьезным успехом. Исследования в этом направлении ведутся и сейчас, поскольку фаготерапия может оказаться действенным оружием против инфекций, вызванных резистентными к антибиотикам бактериями. Больше об истории изучения бактериофагов и о том, как еще их используют, можно узнать из статьи Бактериофаги: 100 лет на службе человечеству.

Бактериофаги играют важную роль в природе. Они активно участвуют в круговороте органических веществ на Земле: по некоторым оценкам число вирусных частиц бактериофагов достигает 10³² — больше, чем всех живых существ вместе взятых (C. A. Suttle, 2005. Viruses in the sea). Постоянная «гонка вооружений» с фагами — один из важных факторов, влияющих на эволюцию бактерий (в том числе и появление более опасных штаммов некоторых патогенных видов). В частности, с фагами борется одна из важных составляющих клеточного иммунитета — система CRISPR, которую ученые несколько лет назад приспособили для редактирования генома. Подробнее этот аспект взаимоотношений фагов и бактерий описан в новости Ученые выяснили, почему бактериофагам трудно бороться с иммунной системой бактерий («Элементы», 18.04.2016).

Сказанного вполне достаточно, чтобы убедиться в том, что изучение бактериофагов — важная часть современной микробиологии. Проблема, однако, в том, что это очень сложно делать. Частицы фагов мелкие, из-за чего их сложно выделять из среды и исследовать. Для их размножения (и существования хоть сколько-нибудь продолжительное время) требуются культуры бактерий, специфичные для изучаемых фагов, и так далее.

И здесь на помощь ученым приходит метагеномика. С развитием ее методов ученые получили возможность выделять генетический материал, содержащийся в пробах из окружающей среды — воды, почвы, грунта из водоемов и т. д. Сейчас буквально можно взять каплю любой грязи и восстановить геномы всех микробов, присутствующих в ней в значимом количестве. Метагеномика приоткрыла завесу тайны над тысячами видов архей, бактерий и вирусов, которые не поддаются культивации в лабораторных условиях (а таких видов среди микроорганизмов большинство): удалось получить последовательности их геномов, предсказать в них гены с известными функциями и составить некоторое представление о биологии этих организмов.

Недавно в журнале Nature были опубликованы результаты масштабного метагеномного исследования, в ходе которого были получены геномные последовательности сотен прежде неизвестных фагов с необычно большими геномами. Надо сказать, что большинство из известных ранее ученым бактериофагов имеют довольно миниатюрные геномы по сравнению с вирусами эукариот. По состоянию на 2017 год были описаны только 93 фаговых генома, состоящие из более чем 200 тысяч пар оснований. Вирусам, в том числе бактериофагам, большой геном, содержащий множество генов, обычно оказывается попросту не нужен: многие ферменты, необходимые для размножения, вирусы заимствуют у клетки-хозяина. Кроме того, большой геном требует больших энергетических затрат для удвоения и упаковки в капсид. Тем не менее, ранее некоторые фаги с большими геномами уже были описаны. Фаги с геномами, в которых от 200 до 500 тысяч пар оснований объединили в группу «джамбофаги» (см.: Y. Yuan, M. Gao, 2017. Jumbo Bacteriophages: An Overview), а фаги с геномами более 500 тысяч пар оснований — в группу «мегафаги» (A. E. Devoto et al., 2019. Megaphages infect Prevotella and variants are widespread in gut microbiomes). В обсуждаемой работе были описаны представители обеих этих групп, поэтому авторы не делали разделения, называя все фаги с большими геномами просто огромными ('huge phages').

Ученые секвенировали ДНК из проб морской и пресной воды, донных осадков, почв, горячих источников, а также из образцов животного и человеческого происхождения (фекалий, выделений ротовой полости) — всего было отобрано 45 проб. Из полученных генетических последовательностей исследователи сумели выделить 351 ранее неизвестную последовательность фагового происхождения, из которых 175 могли принимать кольцевую форму (в большинстве случаев геномы фагов представлены кольцевой молекулой ДНК). Среди этих 175 последовательностей ученым удалось почти полностью собрать 35 новых геномов фагов длиной более 200 тысяч пар оснований. В самом крупном найденном исследователями геноме 735 000 пар оснований — небывалый для вирусов бактерий размер (это больше, чем у некоторых бактерий!). А еще три фаговых генома имеют размер около 640 тысяч пар оснований. До этого рекордный фаговый геном имел 596 тысяч пар оснований. Также был обнаружен один профаг.

Некоторые из собранных фаговых геномов имеют очень низкую для вирусов плотность кодирующих последовательностей (то есть в этих геномах функциональные гены сильно разбавлены некодирующими последовательностями😞 в девяти случаях эта плотность ниже 78%. Авторы исследования предполагают, что обладатели этих геномов используют нестандартный генетический код, отличающийся от того, который использует подавляющее большинство живых организмов. У этих фагов стоп-кодон UAG является кодирующим, поэтому процесс трансляции на нем не обрывается, а продолжается далее. Это пока не позволяет предсказать все гены в их геномах. К слову, нестандартность генетического кода — не уникальное явление. Оно было ранее описано у инфузорий, бактерий, дрожжей и даже у нематод (см. новость Генетический код допускает разночтения («Элементы», 14.01.2009), а также статьи Неоднозначность стоп-кодонов и Самые нестандартные генетические коды). Нестандартный код ранее был описан и у фагов (A. E. Devoto et al., 2019. Megaphages infect Prevotella and variants are widespread in gut microbiomes).

Чем обусловлено увеличение размера генома у огромных фагов? Является ли оно результатом недавнего увеличения геномов фагов с геномами обычного размера, или же огромные фаги — это совершенно особая группа вирусов бактерий, имеющая необычный для фагов набор генов и уникальную жизненную стратегию?

Чтобы ответить на эти вопросы, исследователи построили филогенетическое дерево огромных фагов на основании аминокислотных последовательностей большой субъединицы терминазы (фермент, необходимый для упаковки вирусной ДНК в капсид) и белков капсида (рис. 2). Многие огромные фаги образовали на дереве хорошо обособленные клады, что подтверждает общность их происхождения. Из известных ранее фагов в клады огромных фагов удалось с большой степенью достоверности поместить только фаги с геномами из не менее чем 120 тысяч пар оснований. Примечательно, что четыре фага с самыми крупными геномами вошли в состав одной клады и, следовательно, являются близкими родственниками. Тот факт, что огромные фаги на эволюционном дереве группируются друг с другом, свидетельствует, что большой размер генома оказался довольно стабильным признаком, сохранявшимся в ходе эволюции. При этом в состав одной и той же клады нередко попадали фаги, выделенные из проб совершенно разного происхождения, что свидетельствует о необычайно широком распространении огромных фагов в окружающей среде.

Исследователи также определили, какие бактерии являются хозяевами огромных фагов. Дело в том, что огромные фаги содержат собственные системы CRISPR/Cas, которые используют для регуляции экспрессии генов бактерии-хозяина и конкурентной борьбы друг с другом. Спейсеры в фаговых системах CRISPR/Cas соответствуют фрагментам геномов их бактерий-хозяев, поэтому, анализируя спейсеры в составе фаговой системы CRISPR/Cas, можно установить, какие бактерии этот фаг поражает. Выяснилось, что большинство бактерий-хозяев огромных фагов относится к типам фирмикуты и протеобактерии. Более того, оказалось, что родственные огромные фаги чаще всего поражают также родственные друг другу бактерии.

Любопытно, что огромные фаги не имеют собственного аппарата вставки новых спейсеров в локус CRISPR, а также ферментов, которые разрушают ДНК, комплементарно взаимодействующую с crРНК. Для этих целей они заимствуют соответствующие ферменты у бактерии-хозяина.

Среди генов огромных фагов, функции которых удалось предсказать, оказалось много таких, чьи белковые продукты значительно изменяют биологию клетки-хозяина. Так, в геномах огромных фагов закодированы белки, которые локализуются в клеточной мембране и на поверхности клетки и, вероятно, препятствуют заражению клетки другими фагами, — это своего рода инструмент конкуренции между фагами. Многие огромные фаги имеют ферменты биосинтеза пуриновых и пиримидиновых азотистых оснований, входящих в состав нуклеотидов, а также ферменты, катализирующие химические превращения нуклеотидов. Любопытно, что похожие гены есть у бактерий, которые имеют чрезвычайно маленькие клетки и ведут симбиотический образ жизни (C. J. Castelle et al., 2018. Biosynthetic capacity, metabolic variety and unusual biology in the CPR and DPANN radiations).

Многие огромные фаги имеют гены, белковые продукты которых участвуют в транскрипции и трансляции. В геноме огромного фага может быть закодировано до 67 транспортных РНК (тРНК), играющих важнейшую роль в биосинтезе белков, причем их последовательности отличаются от последовательностей тРНК бактерий-хозяев. Можно сказать, что чем больше геном фага, тем больше в нем генов тРНК. Геномы огромных фагов кодируют до 15 аминоацил-тРНК-синтетаз (эти ферменты связывают тРНК с аминокислотами при синтезе белка), а их аминокислотные последовательности тоже заметно отличаются от последовательностей аналогичных ферментов бактерий-хозяев. Вероятно, собственные тРНК-синтетазы огромные фаги используют для того, чтобы «красть» аминокислоты у клетки-хозяина и встраивать их в свои белки при помощи собственных тРНК. У некоторых огромных фагов даже есть ферменты, модифицирующие тРНК, а также ферменты, «склеивающие» молекулы тРНК, разрушенные защитными системами бактерии-хозяина.

Многие белки огромных фагов служат для «переманивания» аппарата трансляции клетки-хозяина на трансляцию фаговых мРНК. К числу таких фаговых белков относятся некоторые факторы инициации трансляции, а также рибосомные белки. Фаговые рибосомные белки, вероятно, встраиваются в рибосомы бактерий вместо бактериальных белков, и рибосомы, содержащие фаговые белки, начинают трансляцию преимущественно фаговых мРНК, а не бактериальных. Но одной инициацией трансляции дело не ограничивается: в геномах многих огромных фагов закодированы собственные факторы элонгации трансляции, что, вероятно, повышает эффективность синтеза вирусных белков в ходе инфекции. В геномах огромных фагов удалось выявить и факторы терминации трансляции, а также транспортно-матричные РНК и белок SmpB, которые необходимы для отделения от мРНК «зависших» рибосом (когда мРНК повреждена или не имеет стоп-кодона, рибосома часто не может завершить трансляцию и «зависает» на ней). Но помимо описанных выше генов с понятными функциями, у огромных фагов есть много генов с непонятной ролью. Пока лишь ясно, что они не свойственны другим вирусам, описанным на данный момент.

Обсуждаемая работа показала, что огромные фаги — это совершенно особая группа вирусов прокариот. Но пока всё, что мы о них знаем, получено из метагеномных исследований. Для полноценного изучения этих необычных вирусов нужны их вирионы. Желательно вообще научиться выращивать их в лабораторных условиях. Будем надеяться, что вскоре микробиологи продвинутся в этих исследованиях.

Источник: B. Al-Shayeb et al. Clades of huge phages from across Earth’s ecosystems // Nature. 2020. DOI: 10.1038/s41586-020-2007-4.

Елизавета Минина